Metoda aCGH to jeden z ważnych elementów współczesnej diagnostyki genetycznej. Testy genetyczne możemy ogólnie podzielić na celowane i przesiewowe oraz wykrywające jeden z dwóch głównych typów zmian genetycznych – mutacje punktowe albo aberracje chromosomowe. Badanie metodą aCGH to test przesiewowy ukierunkowany na wykrywanie aberracji chromosomowych. Wykonujemy go, kiedy podejrzewamy u pacjenta zaburzenia chromosomowe, np. z powodu opóźnienia rozwoju, autyzmu i/lub wad wrodzonych, ale na podstawie objawów klinicznych nie jesteśmy w stanie wysunąć podejrzenia konkretnego zespołu genetycznego i dlatego musimy przeprowadzić szeroką analizę wszystkich chromosomów.
Kiedy objawy są bardziej charakterystyczne, przemawiając za mikroaberracją dotyczącą konkretnego genu lub regionu chromosomowego, jak w przypadku dystrofii mięśniowej Duchenne’a albo zespołów Pradera i Williego lub Angelmana, można wykonać badanie celowane, najczęściej techniką MLPA.
Podobnie do aCGH i MLPA, które stanowią, odpowiednio, metodę przesiewową i celowaną w diagnostyce zmian chromosomowych, w przypadku wykrywania mutacji punktowych (tzn. dotyczących pojedynczych nukleotydów czyli podstawowych „cegiełek” informacji genetycznej) stosuje się sekwencjonowanie całego eksomu lub genomu jako metodę przesiewową oraz sekwencjonowanie sangerowskie (opracowane przez Fredericka Sangera) przeznaczone głównie do celowanej analizy wybranych genów.
Skrótowy opis metody jest zawarty w jej nazwie – array Comparative Genome Hybridization czyli „porównawcza hybrydyzacja genomowa metodą mikromacierzową”.Podstawą techniki aCGH są mikromacierze czyli szkiełka, na których naniesione są w ściśle określonych pozycjach krótkie jednoniciowe fragmenty DNA, reprezentujące poszczególne regiony każdego z chromosomów. Analiza polega na porównaniu materiału genetycznego pacjenta z prawidłowym DNA wzorcowym. Próbki DNA – pochodzącą od badanego pacjenta i wzorcową – znakuje się różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, np. czerwonym i zielonym, miesza się w równej ilości ze sobą i nakłada na szkiełko. Fragmenty DNA reprezentujące różne regiony chromosomów wiążą się (czyli hybrydyzują) z odpowiednimi cząsteczkami DNA na szkiełku. Jeżeli ilość DNA pacjenta i DNA wzorcowego jest w danym regionie taka sama, otrzymujemy „żółtą” fluorescencję (po zmieszaniu fluorescencji „zielonej” i „czerwonej”). Kiedy jednak pacjent ma delecję (czyli stracił fragment chromosomu) lub duplikację (czyli ma dodatkowy fragment chromosomu), ilość DNA pacjenta będzie w danym regionie mniejsza lub większa niż DNA wzorcowego, czego odzwierciedleniem będzie silniejsza fluorescencja „czerwona” lub „zielona” (w zależności od sposobu wyznakowania próbek). Zmiany fluorescencji są wykrywane przez precyzyjny skaner, a następnie przetwarzane przez specjalistyczne oprogramowanie.
Najważniejszą zaletą metody aCGH jest dużo większa rozdzielczość niż tradycyjnej metody cytogenetycznej, czyli kariotypu. Rutynowo stosowane mikromacierze mają rozdzielczość 100—200 kbp (tysięcy par zasad), podczas gdy w badaniu kariotypu zazwyczaj nie udaje się wykryć zmian mniejszych niż 5 Mbp (milionów par zasad). Przekłada się to na znacznie większą wykrywalność zmian genetycznych za pomocą aCGH. Na przykład wśród dzieci z opóźnieniem rozwoju psychoruchowego lub niepełnosprawnością intelektualną i/lub wadami wrodzonymi, badanie aCGH ujawnia nieprawidłowości w 10—20% przypadków, podczas gdy kariotyp tylko w 3—5%.
Metoda mikromacierzowa (aCGH) ma podstawowe znaczenie w rozpoznawaniu zespołów mikrodelecji i mikroduplikacji- chorób genetycznych spowodowanych utratą fragmentu chromosomu lub występowaniem dodatkowej kopii jakiegoś odcinka chromosomu.
Region mikrodelecji lub mikroduplikacji może mieć różną wielkość i obejmować od kilku lub kilkunastu do kilkudziesięciu, a nawet kilkuset sąsiadujących genów. Większość genów występuje w dwóch kopiach, jednej dziedziczonej do mamy, drugiej od ojca. Niektóre geny nie funkcjonują prawidłowo po utracie jednej lub pojawieniu się dodatkowej kopii, kiedy np. zamiast dwóch, pacjent ma tylko jedną kopię genu w przypadku delecji lub trzy kopie w przypadku duplikacji. Mówimy o takich genach, że są wrażliwe na dawkę. Im większy region delecji lub duplikacji, tym potencjalnie może obejmować więcej genów wrażliwych na dawkę. Defekt każdego z tych genów może mieć różne skutki, przyczyniając się do wieloobjawowego, złożonego obrazu klinicznego. Z tego powodu w badaniu aCGH szczególnie często wykrywamy nieprawidłowości u dzieci z licznymi wadami wrodzonymi, wynikającymi z uszkodzenia wielu genów.
Wrażliwość genu na dawkę może zależeć od tkanki lub narządu. Ze względu na złożoną budowę i skomplikowane funkcje, szczególnie podatny na zaburzenia genetyczne jest mózg. To dlatego w badaniu aCGH mikroaberracje chromosomowe często wykrywamy u dzieci z różnymi zaburzeniami czynności mózgu, takimi jak opóźnienie rozwoju psychoruchowego, niepełnosprawność intelektualna lub zaburzenia ze spektrum autyzmu, ale bez współistniejących wad wrodzonych i innych nieprawidłowości dotyczących innych narządów
Z opisanych wyżej powodów badanie aCGH jest zalecane jako test genetyczny pierwszego wyboru u większości dzieci z wadami wrodzonymi i/lub zaburzeniami neurorozwojowymi, takimi jak opóźnienie rozwoju psychoruchowego, niepełnosprawność intelektualna lub zaburzenia ze spektrum autyzmu.
Zastosowanie metody aCGH nie ogranicza się jednak wyłącznie do tych grup pacjentów. Jak wspomniałem, badanie aCGH zaprojektowano do wykrywania delecji lub duplikacji fragmentów chromosomów. Wiele chorób genetycznych może być uwarunkowanych zarówno mutacjami punktowymi (dotyczącymi pojedynczych nukleotydów), jak również zmianami powodujących delecję lub duplikację fragmentu genu, całego genu lub sąsiadujących genów. Z tego powodu testy genetyczne wykorzystujące techniki sekwencjonowania nowej generacji (next generation sequencing – NGS) i badania metodą aCGH wzajemnie się uzupełniają. Chociaż najnowsze techniki NGS również mogą wykrywać zmiany liczby kopii genów, nie są uznawane w tym względzie za metody referencyjne. Dlatego też, uzyskawszy prawidłowy lub niejednoznaczny wynik badania WES, warto rozważyć badanie metodą aCGH.
Opracowanie nowoczesnych metod analizy genomu, w tym techniki aCGH, umożliwiło prowadzenie badań genetycznych z nieosiągalną wcześniej dokładnością. Efektem tego było wykrycie i opisanie dużej liczby nieznanych wcześniej chorób genetycznych, w tym zespołów mikrodelecji i mikroduplikacji diagnozowanych za pomocą aCGH.
Wiele z tych zespołów opisano dotychczas u zaledwie kilkudziesięciu, czasem wręcz u pojedynczych osób na świecie, a ponieważ scharakteryzowane je dopiero w ostatnich kilkunastu latach okres obserwacji zwykle jest bardzo ograniczony. Nasza wiedza na temat tych zespołów jest zatem wciąż niewielka i lekarzom może być trudno odpowiedzieć na wszystkie pytania pacjentów lub ich opiekunów.
Dodatkową trudnością może być zmienny zakres delecji lub duplikacji danego regionu chromosomowego u różnych pacjentów. U jednego pacjenta obszar aberracji może być większy, obejmując więcej genów, u innego – krótszy z mniejszą liczbą genów. Chociaż zazwyczaj można określić minimalny utracony lub zduplikowany obszar wspólny dla wszystkich pacjentów z określonym zespołem, to jednak zwykle różnią się oni pod względem liczby dodatkowych genów znajdujących się w obrębie aberracji.
W przypadku wykrycia duplikacji nie jesteśmy pewni, gdzie znajduje się dodatkowy materiał genetyczny. Dodatkowa kopia fragmentu jednego chromosomu może zostać dołączona do innego chromosomu, niekiedy uszkadzając inny gen lub geny w tym chromosomie. Ustalenie umiejscowienia zduplikowanego fragmentu wymaga dodatkowych badań, które nie zawsze są dostępne rutynowo.
Należy podkreślić, że wiele regionów chromosomowych występuje w zmiennej liczbie kopii jako zjawisko naturalne (copy number variation – CNV), będące przejawem normalnej zmienności genetycznej. Nie zawsze jednak jesteśmy w stanie ustalić, czy wykryty u pacjenta rzadki wariant CNV to zmiana łagodna/neutralna, czy jednak patogenna, odpowiedzialna za nieprawidłowe objawy kliniczne. Pomocne w tej sytuacji może być wykonanie badania na nosicielstwo u zdrowych rodziców. Jeżeli wykryjemy ten sam wariant u jednego z nich, może to być przesłanką łagodnego charakteru zmiany (skoro występuje również u zdrowego rodzica). Interpretacja kliniczna musi być jednak bardzo ostrożna, ponieważ niektóre warianty CNV wiążą się ze zwiększonym ryzykiem określonych zaburzeń, np. autyzmu, ale nie wywołują takich zaburzeń u wszystkich nosicieli. O takich zmianach mówimy, że są czynnikami ryzyka rozwoju choroby, prowadzącymi do jej wystąpienia w przypadku współistnienia innych niekorzystnych czynników (genetycznych lub nabytych), ale samodzielnie nie są w stanie wywołać zaburzeń.
Rozpoznanie swoistego zespołu mikrodelecji lub mikroduplikacji umożliwia zazwyczaj jednoznacznie ustalenie etiologii występujących u pacjenta objawów, wykluczając inne potencjalne przyczyny. Pozwala to uniknąć dalszych niepotrzebnych badań i odpowiednio ukierunkować postępowanie lecznicze.
Bardzo duże znaczenie ma również możliwość dokładnego oszacowania ryzyka wystąpienia tego samego zespołu u kolejnych dzieci. Zespoły mikroaberracji chromosomowych często występują jako pojedyncze zachorowania w rodzinie i nie wiążą się z dużym ryzykiem powtórzenia się, ale ustalić to można dopiero na podstawie wyników badań genetycznych u dziecka i jego rodziców.
Chociaż, jak wspomniałem wcześniej, dane naukowe dotyczące wielu nowo opisanych zespołów genetycznych są często ograniczone, nie oznacza to, że na podstawie dostępnych informacji nie możemy wyciągnąć praktycznych wniosków. Na przykład częste występowania poważnych zaburzeń mowy (afazji), w opisanych już przypadkach danego zespołu, jest wskazówką, aby wcześnie rozpocząć naukę komunikacji pozawerbalnej. Opisy innych przypadków mogą również pomóc w rozpoznaniu współistniejących zaburzeń, które pozostają jeszcze utajone (np. zaburzenia czynność nerek), lub przewidzieć problemy kliniczne, które mogą się ujawnić w przyszłości (np. napady padaczkowe). W niektórych przypadkach możliwe jest zastosowanie leczenia, które pozwala opanować przynajmniej część objawów klinicznych. Przykładem w tym względzie może być terapia hormonem wzrostu u pacjentów z zespołem Pradera i Williego.
Jak dotąd nie zarejestrowano skutecznych i bezpiecznych metod terapii genowej, które pozwoliłyby naprawiać defekty genetyczne w zespołach mikroaberracji chromosomowych związanych z delecją lub duplikacją wielu genów. Prowadzone są jednak w tym zakresie badania naukowe. W dużym skrócie zmierzają one do zwiększenia ekspresji genów, które występują tylko w jednej kopii w przypadku delecji, lub ograniczenia aktywności genów będących w nadmiarze w przypadku duplikacji.
W odniesieniu do naprawy pojedynczych genów wielkim sukcesem ostatnich lat było opracowanie kilku terapii przywracających wytwarzanie białka SMN, którego niedobór jest przyczyną ciężkiej choroby genetycznej – rdzeniowego zaniku mięśni (SMA). Można mieć uzasadnione nadzieje, że w przyszłości nowoczesne terapie genowe staną się dostępne również w wielu innych chorobach genetycznych.
Rozpoznanie konkretnego zespołu genetycznego może pomóc ustalić, które ośrodki naukowe w Polsce, Europie i na całym świecie prowadzą badania nad tym zespołem. Nawiązanie kontaktu z tymi ośrodkami może zaowocować w przyszłości zaproszeniem do udziału w badaniach klinicznych nowych metod terapii.