Na czym polegają badania całogenomowe?

Co kryje się pod hasłem “badania całogenomowe”?

Jeżeli u pacjenta podejrzewamy mutację jednego konkretnego genu możemy zastosować tradycyjną metodę sekwencjonowania sangerowskiego. Kiedy jednak obraz kliniczny u pacjenta jest mało swoisty i nie jesteśmy w stanie dokładnie przewidzieć, który gen może być uszkodzony, to należy rozważyć badanie przesiewowe wielu genów metodą sekwencjonowania nowej (następnej) generacji (next generation sequencing – NGS).

Wyróżnia się dwa główne typy NGS – sekwencjonowanie całego eksomu (whole exome sequencing – WES) i sekwencjonowanie całego genomu (whole genome sequencing – WGS). WES ogranicza się do analizy całego eksomu, czyli wszystkich eksonów, które zawierają sekwencję kodującą, zawierającą informację o budowie wszystkich białek organizmu. Eksony stanowią nieco >1% całej sekwencji genomu, ale zawierają ok. 85% patogennych wariantów genetycznych. Z tego powodu w diagnostyce genetycznej częściej wykonuje się badanie WES, które jest szybsze i tańsze niż badanie WGS. Badanie WGS ma jednak znacznie szerszy zakres, obejmujący nie tylko sekwencję kodującą zawartą w eksonach, ale również rozległe sekwencje niekodujące białek. W przeszłości uważano, że sekwencje niekodujące nie pełnią żadnej funkcji, stanowiąc swego rodzaju „genetyczne śmieci” (junk DNA). Dzisiaj natomiast wiemy, że mają one bardzo ważne znaczenie, regulując funkcjonowanie genomu poprzez właściwą aktywację poszczególnych genów.

Badania wykonywane metodą NGS, czyli WES i WGS pozwalają na wykrywanie nie tylko mutacji punktowych, ale również drugiego ważnego typu mutacji, tzn. rozległych zmian strukturalnych, polegających na delecji (utracie) lub duplikacji (pojawieniu się dodatkowej kopii) fragmentu genu, całego genu lub kilku sąsiadujących genów. Niemniej jednak za referencyjne techniki wykrywania rozległych delecji/duplikacji wciąż uznaje się metodę MLPA (w odniesieniu do pojedynczych genów) lub technikę mikromacierzową aCGH (badanie przesiewowego całego genomu w kierunku delecji/duplikacji większych fragmentów obejmujących typowo od kilku do kilkuset różnych genów).

Pomimo bardzo szerokiego zakresu analizy badania WES ani WGS nie wykrywają rutynowo niektórych szczególnych i rzadszych typów wariantów genowych, takich jak mutacje dynamiczne lub zaburzenia metylacji.

Kiedy zleca się pacjentowi wykonanie badań całogenomowych?

Wskazaniem do wykonania badania przesiewowego całego eksomu (WES) lub całego genomu (WGS) jest podejrzenie choroby genetycznej u pacjenta z mało swoistymi objawami klinicznymi, które mogą być następstwem uszkodzenia jednego z wielu różnych genów. Chociaż badanie WES pozwala wykryć większość (ok. 85%) wariantów patogennych, badanie WGS dostarcza pełniejszych informacji. Zaletą badania WGS jest również bardziej równomierna jakość analizy eksomu (w badaniu WES jakość odczytu niektórych eksonów, zwłaszcza umiejscowionych na krańcu 5’ genu, czyli w jego części początkowej, może być gorsza niż pozostałych).

Analiza i interpretacja znacznie obszerniejszych danych WGS trwa jednak dłużej i jest bardziej złożona. Interpretację może ułatwić równoczesna analiza WES lub WGS pacjenta i obojga jego rodziców. Porównując występowanie różnych wariantów genetycznych u chorego dziecka i jego rodziców, można łatwiej ustalić, która mutacja odpowiada za objawy chorobowe.

W jakich sytuacjach klinicznych wykonanie badań całogenomowych jest konieczne/niezbędne?

Zmniejszające się systematycznie koszty i coraz większa dostępność badań genetycznych sprawiają, że wskazania do ich stosowania są coraz szersze. Bardzo możliwe, że w przyszłości badania całogenomowe, WES lub WGS, będą zalecane dla wszystkich ludzi jako metoda profilaktyczna, służąca wczesnemu rozpoznawaniu osób zagrożonych np. chorobami nowotworowymi z powodu dziedzicznej skłonności genetycznej.

Obecnie wskazaniem do badania WES lub WGS jest choroba o podejrzewanym podłożu genetycznym (po uprzednim starannym wykluczeniu możliwych przyczyn niegenetycznych), kiedy nie możemy wskazać z dużym prawdopodobieństwem, który gen jest uszkodzony.

Na przykład u 4-letniego chłopca mającego trudności w chodzeniu, przerośnięte łydki i stężenie kinazy kreatynowej na poziomie kilku tysięcy U/l należy wykonać celowaną analizę genu DMD, ponieważ opisane objawy są bardzo charakterystyczne dla jednej konkretnej choroby – dystrofii mięśniowej Duchenne’a. Kiedy jednak objawy są mniej swoiste, np. pacjent ma trudności we wchodzeniu po schodach lub czesaniu włosów i inne objawy niedowładu obręczowo-kończynowego diagnostyka różnicowa obejmuje co najmniej kilkadziesiąt potencjalnych przyczyn genetycznych, z których każda zależy od uszkodzenia innego genu. W tej sytuacji zdecydowanie należy rozważyć badanie WES lub WGS.

Jak powinno wyglądać prawidłowo opracowane zlecenie badań całogenomowych? Jakich informacji nie może w nim zabraknąć?

Badania WES lub WGS składają się z dwóch głównych etapów. Na pierwszym etapie generowana jest sekwencja całego eksomu lub genomu pacjenta, która na drugim etapie poddawana jest szczegółowej analizie bioinformatycznej, ukierunkowanej przede wszystkim na te warianty genetyczne, które mogą tłumaczyć występujące u pacjenta objawy. Podstawowe znaczenie ma zatem dokładne opisanie objawów czyli fenotypu pacjenta. Jeżeli opis fenotypu będzie nieprecyzyjny lub pominie istotne informacje kliniczne, wyniki badania WES lub WGS mogą być niemiarodajne.

Bardzo ważne jest stosowanie w komunikacji z laboratorium genetycznym wystandaryzowanego języka zrozumiałego zarówno dla lekarza, jak i diagnosty laboratoryjnego. Należy unikać długiej epikryzy, starając się raczej wymienić kluczowe cechy kliniczne pacjenta, podobnie jak pisząc artykuł, dobiera się odpowiednie słowa kluczowe. Powszechnie w tym celu stosuje się bazę Human Phenotype Ontology (https://hpo.jax.org/app/), zawierającą wystandaryzowane terminy kliniczne (w języku angielskim), powiązane z odpowiednimi genami (których mutacje wykryto uprzednio u pacjentów z określoną chorobą lub objawem).

Na przykład w przypadku dziecka z wrodzonym zanikiem nerwów wzrokowych, rdzeniowym zanikiem mięśni i padaczką można podać następujące terminy: optic atrophy (HP:0000648), spinal muscular atrophy (HP:0007269) oraz seizures (HP:0001250). Oczywiście można ograniczyć się do polskich odpowiedników. Konieczne jest również zwięzłe opisanie wywiadu rodzinnego, podając, czy w rodzinie są lub byli krewni z podobnymi objawami. Należy pamiętać, że niektóre choroby genetyczne mogą wykazywać różne, niekiedy pozornie niezwiązane ze sobą fenotypy kliniczne, jak np. niepełnosprawność intelektualna, przedwczesna menopauza czy zespół drżenia i ataksji w zależności od płci, wieku i typu mutacji u nosicieli permutacji lub mutacji pełnej genu FMR1.

Kto powinien dokonać interpretacji wyników badania całogenomowego?

Wstępnej interpretacji wyniku badania WES lub WGS dokonuje odpowiednio wyszkolony i doświadczony bioinformatyk. Sporządza on listę wykrytych u pacjenta wariantów genetycznych, które mogą mieć związek z opisanym na skierowaniu fenotypem klinicznym pacjenta. Warianty genowe powszechnie klasyfikuje się zgodnie z pięciostopniową klasyfikacją jako patogenny, prawdopodobnie patogenny, łagodny, prawdopodobnie łagodny lub wariant o nieznanym znaczeniu klinicznymi (variant of unknown significance – VUS). Najpierw raportowane są warianty, których związek z chorobą pacjenta, jest najbardziej prawdopodobny, a w dalszej kolejności te, których znaczenie kliniczne jest mniej pewne. Warianty łagodne i prawdopodobnie łagodne nie są rutynowo uwzględniane w raporcie.

Należy pamiętać, że wraz z postępem badań naukowych warianty klasyfikowane dotychczas jako VUS, mogą z czasem zyskać jednoznaczną klasyfikację jako zmiany patogenne lub łagodne. W rzadkich przypadkach może się również zdarzyć, że wariant uznawany wcześniej za patogenny okaże się w świetle nowych danych nieistotny klinicznie. Z tego powodu wskazana może być powtórna analiza bioinformatyczna wyników WES lub WGS po pewnym czasie (np. 2—5 latach), szczególnie gdy pierwotne rozpoznanie budziło wątpliwości lub pojawiły się nowe objawy kliniczne.

Ostatecznej interpretacji wyniku badania WES lub WGS dokonuje specjalista genetyk na podstawie szczegółowej analizy listy wykrytych wariantów genetycznych w kontekście całości obrazu klinicznego pacjenta. Taka interpretacja kliniczna może być trudna i wymaga uwzględnienia wielu danych. Na przykład, stwierdzenie wariantu patogennego w jednym allelu danego genu w przypadku choroby dziedziczonej autosomalnie recesywnie nie oznacza automatycznie występowania tej choroby, której rozpoznanie wymaga wykrycia mutacji patogennych w obu allelach.

W jaki sposób wynik badania całogenomowego może wpłynąć na życie pacjenta i dalszy przebieg leczenia?

Dzięki bardzo szerokiemu zakresowi analizy, obejmującej cały eksom lub genom, badania WES lub WGS w wielu przypadkach pozwalają znacznie skrócić proces diagnostyczny i szybko ustalić u pacjenta jednoznaczne rozpoznanie. Znam wielu pacjentów, u których długimi latami bezowocnie poszukiwano przyczyny choroby za pomocą dostępnych w przeszłości metod. Dopiero nowoczesne badania całego eksomu lub genomu doprowadziły do ustalenia rozpoznania swoistego zespołu genetycznego, którego nawet nie bylibyśmy wcześniej w stanie podejrzewać.

Oczywiście, rozpoznanie rzadkiego zespołu genetyczne zazwyczaj nie oznacza, że dostępne jest od razu skuteczne leczenie przyczynowe. Warto jednak podkreślić ogromne postępy w leczeniu chorób genetycznych, czego szczególnie dobitnym przykładem są najnowsze terapie rdzeniowego zaniku mięśni. Można mieć nadzieję, że doświadczenia zebrane w leczeniu tej i innych chorób genetycznych, doprowadzą w końcu do opracowania skutecznych metod terapii innych zespołów genetycznych, których nie potrafimy jeszcze leczyć.

Nawet w sytuacji, gdy leczenie przyczynowe nie jest dostępne, pacjent, u którego ustalono swoisty defekt genetyczny, jest w znacznie lepszej sytuacji niż osoba pozostająca wciąż bez jednoznacznego rozpoznania. Po wykryciu mutacji konkretnego genu można skierować wszystkie wysiłki na leczenie swoistej przyczyny choroby, zamiast rozpraszać środki na przypadkowe terapie o niepotwierdzonej skuteczności. Poznanie swoistej przyczyny genetycznej otwiera też perspektywy potencjalnego udziału pacjenta w badaniach klinicznych nowych metod leczenia.